NovaFISH是由图维生物医药科技（苏州）有限公司开发的业界首款多重单分子荧光原位杂交（smFISH）探针。NovaFISH 可用于检测 DNA/RNA 表达，并实现数字化定量分析，适用于分离的 DNA/RNA、固定的细胞、固定的组织切片或与免疫荧光染色配合使用。

NovaFISH 还可与免疫荧光染色 (IF) 结合使用，适用于在固定细胞中同时检测 RNA（通过 NovaFISH）和蛋白质（通过免疫荧光染色）。本手册包含以下实验步骤：免疫荧光染色和 NovaFISH 染色。

免疫荧光染色

1. 细胞固定

细胞培养在直径 13 mm 的 #1 盖玻片上。用 3% PFA/PBS 室温固定 10 分钟。1 mL PBS 室温洗涤 1 分钟。0.5% Triton-100/PBS 室温洗涤 10 分钟，最后用 PBS 室温洗涤 1 分钟。

2. 一抗孵育

加入一抗，室温孵育 1 小时。PBS 室温洗涤 4 次，每次 5 分钟。

3. 二抗染色

加入二抗，在黑暗条件下室温孵育 1 小时。PBS 室温洗涤 3 次，每次 5 分钟。

提示： NovaFISH 染色应紧随 IF 染色步骤，以最大程度保持信号。

NovaFISH 染色

1. 探针制备

将 NovaFISH nano 探针重悬于 10 μL 无 DNase/RNase 水（如 DEPC 处理水）。对于 NovaFISH mini、midi 和 maxi 探针，分别用 40 μL、200 μL 和 500 μL 的水重悬。

2. 细胞制备

使用 4% 甲醛的1x PBS室温固定已完成抗体染色的细胞，固定10 分钟。移除甲醛，用 135 mM Glycine的1x PBS 溶液室温洗涤 10 分钟去除残余甲醛。

提示：如果您的细胞系需要涂层，可用适合细胞贴附和生长的试剂涂覆盖玻片。在用 4% 甲醛固定细胞之前，细胞应在不同密度（10%-100%）下生长至少一晚以确保其能够充分附着于盖玻片。固定也可使用 4% 多聚甲醛的 1x PBS 溶液。建议使用 12 孔或 24 孔培养板进行细胞培养、固定和洗涤步骤。

3. 去除残留甲醛

1x PBS 洗涤一次，静置 10 分钟去除残留物。然后将样品置于 70% 乙醇中，4 ℃保存过夜。

提示：细胞也可以存储在 -20 ℃的 70% 乙醇中，保存数月。建议使用封口膜或胶带密封含有固定细胞的培养板以减少乙醇挥发。定期检查培养孔内乙醇水平以确保细胞未干涸。

4. NovaWash 洗涤细胞

在杂交之前，用 NovaWash在室温下洗涤盖玻片两次，每次 10 分钟。

提示：可使用摇床进行洗涤，以更好地去除残留乙醇。

5. NovaFISH 探针染色

取0.5 μL 的 NovaFISH 探针加入到 50 μL 的 NovaHyb溶液中，形成工作液。用胶水在干净的载玻片上画一个圈以限制溶液区域，吸取 10 μL 工作液加入圈内。将盖玻片上的细胞面朝下放在液滴上。用胶水封住盖玻片边缘。保持湿润环境，30 ℃杂交过夜。

提示：通过观察盖玻片可区分细胞培养面和未培养面。细胞培养面在光下的反射较弱。此外，可在显微镜下观察并轻轻划伤盖玻片，如果有细胞脱落，即为细胞面。

6. 去除未结合的探针

使用 NovaWash 在培养孔中洗涤盖玻片 4 次，每次 10 分钟，室温下进行。

提示：也可选择洗涤两次，每次 30 分钟，或在 4 ℃条件下洗涤过夜，信号仍可保持良好。可在首次洗涤时加入对比染色剂（如 DAPI），并通过后续步骤洗去多余染色剂。

7. 装片

用干净的纸巾轻轻吸去盖玻片上的残余液体。在干净的玻片上滴加 10 μL 封片溶液（ProLong? Glass Antifade Mountant，ThermoFisher Scientific，目录号：P36982），立即将盖玻片细胞面朝下放置其上。样品存放在 4 ℃直至使用。

提示：使用合适的激光通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对样品进行成像（新型号的显微镜通常成像效果更佳）。NovaFISH 探针标记为 Atto488、Atto565 和 Atto647N 的组合。