NovaFISH是由图维生物医药科技（苏州）有限公司开发的业界首款多重单分子荧光原位杂交（smFISH）探针。NovaFISH 可用于检测 DNA/RNA 表达，并实现数字化定量分析，适用于分离的 DNA/RNA、固定的细胞、固定的组织切片或与免疫荧光染色配合使用。

本手册针对固定组织样本中的NovaFISH应用，包括组织切片制备及NovaFISH染色的操作步骤。

组织切片制备

1. 制备组织块

对于冷冻切片样本，将组织样本尽快用O.C.T在干冰上快速冷冻（-78℃，3分钟内），或直接在液氮平衡的2-甲基丁烷中冷冻（约-150℃，1分钟内）。切片前存放于-80℃。对于FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本，按照标准程序使用福尔马林固定并石蜡包埋。石蜡包埋组织块可在-20℃或-80℃存储。

提示：NovaFISH适用于冷冻切片和FFPE切片。为保证RNA质量，组织块应存放在4℃或更低温度，以防止化学降解和RNase介导的降解。

2. 组织切片和安装

将组织块切片至3-5 μm的厚度，最佳适配NovaFISH染色。切片安装在具有多聚赖氨酸或其他胺基涂层的13 mm盖玻片上。对于FFPE切片，样本需在37℃热板上额外烘焙2小时以增强附着力。对于冷冻切片，应在冷冻切片机（如Leica冷冻切片机）中以-20℃切片。

提示：

• NovaFISH也可用于较厚组织（如10-20 μm），甚至是Platynereis的整体胚胎（厚度约100 μm）。较薄切片通常能减少背景噪声，并减少显微镜成像时的衍射伪影。
• 冷冻切片应在室温下放置，以便与盖玻片高效结合。切片完成后，盖玻片需立即转移至装有干冰的24孔细胞培养板，或在冷冻切片机中存放（约-20℃），然后一起转移至干冰上的培养板中，最终储存在-80℃。
• 运输未固定冷冻切片时，需将整个24孔板密封（如用胶带），并置于足够干冰的容器内，确保运输过程中样本始终低温保存。FFPE切片则可在室温下运输。

3a. 固定（冷冻切片可选）

将未固定的冷冻切片置于4%甲醛（1xPBS溶液中）中固定10分钟。随后在135 mM甘氨酸（1xPBS溶液中）中反应10分钟以淬灭固定反应。再用1xPBS清洗10分钟以去除残留的甲醛和甘氨酸。最后，样本需在-70%乙醇中于4℃渗透过夜。

提示：

• 所有缓冲液应为DEPC处理过的溶液。
• 固定后，冷冻切片中的RNA稳定性增强，对RNase稍具抗性，但仍易受热引起的化学降解影响。固定后的切片应保存在-20℃的70%乙醇中，RNA稳定性可保持数月至一年。
• 固定后的样本可适合运输。运输时需保证-20℃，并使用足够的70%或更高浓度的乙醇。运输过程中需将24孔板密封。

3b. 去除石蜡（FFPE切片可选）

将盖玻片上的石蜡切片用二甲苯处理两次，每次1小时。随后依次用100%、95%和70%的乙醇梯度清洗残余的二甲苯，每步10分钟。

提示：延长二甲苯处理时间（总计2小时）可最大程度去除石蜡，从而降低背景染色。处理时间过长会破坏样本。RNA修复步骤（如80℃，0.01 M醋酸钠pH 6.0中加热30分钟）通常能改善信号。

NovaFISH 染色

1. 探针制备

将 NovaFISH nano 探针重悬于 10 μL 无 DNase/RNase 水（如 DEPC 处理水）。对于 NovaFISH mini、midi 和 maxi 探针，分别用 40 μL、200 μL 和 500 μL 的水重悬。

2. NovaWash 洗涤细胞

在杂交之前，用 NovaWash在室温下洗涤盖玻片两次，每次 10 分钟。

提示：可使用摇床进行洗涤，以更好地去除残留乙醇。

3. NovaFISH 探针染色

取0.5 μL 的 NovaFISH 探针加入到 50 μL 的 NovaHyb溶液中，形成工作溶液。用胶水在干净的载玻片上画一个圈以限制溶液区域，吸取 10 μL 工作溶液加入圈内。将盖玻片上的细胞面朝下放在液滴上。用胶水封住盖玻片边缘。保持湿润环境，30 ℃杂交过夜。

提示：通过观察盖玻片可区分细胞培养面和未培养面。细胞培养面在光下的反射较弱。此外，可在显微镜下观察并轻轻划伤盖玻片，如果有细胞脱落，即为细胞面。

4. 去除未结合的探针

使用 NovaWash 在培养孔中洗涤盖玻片 4 次，每次 10 分钟，室温下进行。

提示：也可选择洗涤两次，每次 30 分钟，或在 4 ℃条件下洗涤过夜，信号仍可保持良好。可在首次洗涤时加入对比染色剂（如 DAPI），并通过后续步骤洗去多余染色剂。

5. 装片

用干净的纸巾轻轻吸去盖玻片上的残余液体。在干净的玻片上滴加 10 μL 封片溶液（ProLong? Glass Antifade Mountant，ThermoFisher Scientific，目录号：P36982），立即将盖玻片细胞面朝下放置其上。样品存放在 4 ℃直至使用。

提示：

• 样本亦可用2xSSC直接安装并立即成像。
• 成像建议：使用合适的激光通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对样品进行成像（新型号的显微镜通常成像效果更佳）。NovaFISH 探针标记为 Atto488、Atto565 和 Atto647N 的组合